近日，上海科技大学iHuman研究所/生命科学与技术学院赵素文课题组在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上发表题为“Discovery and biosynthesis of a novel diaminopropane-modified thymine in phage DNA”的研究论文，报道了在鲍曼不动杆菌噬菌体SH-Ab 15599中发现一种新型胸腺嘧啶超修饰——α-（1,3-二氨基丙基）胸腺嘧啶（α-1,3-diaminopropanylthymine，简称dapT），并揭示了其生物合成通路、关键酶的底物选择机制及其在噬菌体抵御宿主防御中的作用。
DNA除A、T、C、G四种经典碱基外，还存在多种修饰碱基。噬菌体基因组中的DNA修饰尤为丰富，这些修饰能够帮助噬菌体抵御宿主的限制–修饰系统、CRISPR-Cas系统及其他细菌防御系统。近年研究发现，噬菌体编码的α-GPT-Pplase2酶家族能够利用不同的小分子供体，将多样化的基团连接至经磷酸化活化的5-羟甲基尿嘧啶（5hmdU）上，形成胸腺嘧啶超修饰（图1）。该家族还能够催化生成哪些未知修饰，仍有待探索。
图 1 DNA中未修饰、修饰及超修饰的胸腺嘧啶
发现新型DNA超修饰dapT，揭示关键酶的底物选择机制
噬菌体SH-Ab 15599与PhiW-14的Pplase2在序列相似性网络中属于同一簇，但二者的序列同一性仅约35%。PhiW-14的Pplase2以腐胺为修饰供体，而SH-Ab 15599的宿主鲍曼不动杆菌细胞内几乎不含腐胺。这提示，SH-Ab 15599的Pplase2可能利用不同供体，催化生成尚未被发现的DNA超修饰。
为鉴定其供体底物，团队选取53种含氨基的小分子代谢物进行筛选，确认了一种由1,3-丙二胺参与形成的新型修饰核苷dapT。进一步实验表明，该酶能够利用多种不同碳链长度的线性二胺及组胺生成相应的超修饰核苷，但利用能力存在差异。当多种线性二胺同时存在时，由1,3-丙二胺衍生的dapT成为主要产物。研究团队据此将该酶命名为二胺DNA转移酶（diamine DNA transferase，简称DADT）。
将超修饰合成系统导入大肠杆菌，外源添加1,3-丙二胺时，系统能够在大肠杆菌DNA中生成dapT；不添加时，则利用大肠杆菌内源的腐胺，生成腐胺修饰的胸腺嘧啶putT。这表明，噬菌体DNA超修饰的类型不仅取决于DADT的底物选择性，也受到宿主代谢物丰度及其竞争关系的影响。
结合结构模型与定点突变实验，本研究鉴定了参与金属离子配位、催化及供体选择的关键氨基酸残基。并通过引入G227K/D238Y双突变，使DADT失去利用1,3-丙二胺的能力，转而以甘氨酸为供体生成glyT。这表明，Pplase2家族在共享催化框架的同时，其供体结合口袋具有较强的可塑性，改变少数关键残基即可重塑供体偏好，为此类酶的定向改造提供了依据。
确认dapT为天然修饰，揭示其抵御宿主防御的功能
研究进一步分离纯化了SH-Ab 15599噬菌体基因组DNA，并通过液相色谱–质谱分析，确认dapT是该噬菌体基因组中的天然修饰。定量分析显示，噬菌体DNA中约23%的胸腺嘧啶被修饰为dapT。进一步分析发现，dapT在噬菌体基因组中的分布具有序列偏好，优先出现在TG二核苷酸位点。
功能实验还表明，dapT修饰能够增强噬菌体DNA对多种限制性内切酶切割的抵抗能力，从而帮助噬菌体抵御宿主限制–修饰系统对其DNA的识别和切割。
揭示噬菌体感染伴随宿主多胺代谢重编程
dapT的形成需要充足的1,3-丙二胺。通过时间分辨RNA测序发现，噬菌体感染后，鲍曼不动杆菌中与1,3-丙二胺合成相关的基因表达上调，而与其消耗或竞争性代谢通路相关的基因表达下调。这提示，噬菌体感染伴随着宿主1,3-丙二胺代谢的重编程，可能有助于保障dapT合成所需的前体供应。由此揭示了一种酶催化与宿主代谢协同作用的策略：宿主代谢变化可能为超修饰反应提供前体，DADT则催化前体与DNA连接，促进超修饰形成。
值得关注的是，1,3-丙二胺在鲍曼不动杆菌中还参与细菌运动和生物膜形成的调控。不过，目前相关证据主要来自转录组及代谢通路分析，是否会显著影响宿主的生物膜形成能力，仍需进一步实验验证。
图 2 噬菌体DNA中dapT修饰的生物合成与功能
综上，本研究发现了新型DNA超修饰dapT，阐明了其生物合成机制及关键酶DADT的底物选择性，揭示了dapT增强噬菌体DNA抵御限制性内切酶切割的作用，并发现噬菌体感染伴随宿主多胺代谢重编程。该研究为理解噬菌体与宿主的相互作用及共进化提供了新视角，也为未知DNA超修饰的发掘、修饰DNA的生物合成及基于噬菌体的抗菌技术开发提供了新思路。
上海科技大学iHuman研究所助理研究员李文婧、iHuman研究所/生命科学与技术学院博士生陈荟玉和马皓宇为论文共同第一作者，上海科技大学iHuman研究所/生命科学与技术学院赵素文教授为通讯作者，上海科技大学为第一完成单位。
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